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El investigador del siglo XVII, Antonio de León Pinelo, es quien defiende que fue Felipe II en persona quien reclamó la canonización y que fray Domingo de Mendoza llevó a cabo todos los trámites. El cronista Joseph de la Cruz concede el protagonismo del proceso a Diego de Salas Barbadillo, quien habría solicitado la canonización al rey Felipe II en nombre de la Villa madrileña. Ciertamente hubo un empeño popular en que existiera canonización. La primera noticia oficial acerca del intento de canonización de Isidro aparece en los Libros de Actas del ayuntamiento madrileño el 23 de diciembre de 1562. Según figura en el acta, se presentó ante el concejo una comisión formada por tres miembros de la familia de los Lujanes y uno de los Vargas-Luján. Dichos vecinos plantearon que, aprovechando que el Comendador mayor de Castilla viajaba a Roma para la canonización de Diego de Alcalá, se hiciera allí mismo también el trámite de canonización de Isidro. El escritor Diego de Salas Barbadillo sin saber qué documentos consulta previamente, anuncia en el ayuntamiento de Madrid en el año 1592, obra que según autores se supone que fuera de su padre Alonso Jerónimo de Salas Barbadillo. El Ayuntamiento durante este periodo intentó buscar y reunir los documentos sobre la vida y hechos de San Isidro. Se hicieron bandos y se publicaron cartas de excomunión a proporcionar a aquel que proporcionara documentos. Pronto hubo fraudes que fueron denunciados mediante publicaciones de paulinas.
Fue beatificado por el papa Paulo V el 14 de junio de 1619, y el 12 de marzo de 1622 canonizado por Gregorio XV, junto a san Felipe Neri, santa Teresa de Jesús, san Ignacio de Loyola y san Francisco Javier, aunque la bula de canonización no fue publicada hasta 1724 por Benedicto XIII reinando ya en España Felipe V. La canonización hizo que se celebraran grandes fiestas en Madrid. Se determinó además que su festividad se celebraría el 15 de mayo y se aprobó su Patronazgo sobre la Villa y Corte de Madrid. A causa de este acontecimiento, la Cofradía de San Eloy de los Plateros de Madrid decidió donar un arca de plata para sustituir la vieja de madera de Alfonso VIII. El arca de los Plateros tenía en plata y bronce. El pueblo de Madrid reclama la edificación de una nueva capilla, que acogiera las reliquias y resultara de mayor envergadura y suntuosidad. En 1642 ya se había aprobado el proyecto del arquitecto Pedro de la Torre para la erección de una nueva capilla y se había comenzado la construcción de la misma, pero las obras fueron languideciendo hasta que en 1656 éstas se encontraban en completa ruina. El punto central de la capilla debía ser un baldaquino de estilo barroco, para el que presentó un diseño el artista Sebastián Herrera Barnuevo. Ya Felipe III antes de que San Isidro fuera canonizado, en el momento de su muerte, pedía al Santo que fuera su interlocutor ante Dios Padre.
El poder curativo del Santo se confió a la reina Doña Mariana de Neoburgo cuando en el verano de 1691 cayó enferma de gravedad debido a los remedios empleados por los médicos para la época para provocar el embarazo. Mariana fue la segunda esposa del rey Carlos II, el último monarca de la dinastía de la casa real de los Austrias. Se le administraron a Mariana los últimos sacramentos y se llevó en procesión el cuerpo de San Isidro al Alcázar para que este intercediera por la curación, en caso de fallecimiento, de la soberana. Durante nueve días consecutivos se oró en el Monasterio de las Descalzas, y por él pasaron todas las órdenes religiosas afincadas en Madrid. A principios de octubre de 1691 la enfermedad comenzó a remitir y en la Corte tuvieron lugar diferentes festejos para celebrar el restablecimiento de la reina. Al verse curada Mariana encargó una urna de plata para albergar las reliquias del Santo. En enero de 1692 la urna fue terminada y los costes fueron cargados a la nómina real. La antigua urna pasó a propiedad de Mariana. Durante su exilio en Toledo, de 1701 a 1706, la reina viuda había llevado consigo la antigua urna. Sin embargo, en su salida precipitada hacia Bayona parte de sus bienes quedaron en Toledo.
Durante años se creyó que su cuerpo incorrupto tenía poderes sanadores y la Familia Real española se valió de esta cualidad milagrosa a lo largo de la historia. Por ejemplo, cuando Felipe III enfermó de unas calenturas al regresar de Portugal y se vio obligado a permanecer en Casarrubios del Monte, en Toledo. La villa de Madrid organizó entonces una procesión por la curación del monarca y el cuerpo del Santo fue trasladado a esta localidad toledana. Durante el reinado de Carlos II también se confió en el Santo para que intercediera por su salud, trasladando sus reliquias al Alcázar Real de Madrid en 1696.
Los Borbones mantuvieron la creencia en los poderes curativos de la momia del santo y, en 1760, se llevó el cuerpo al Palacio Real durante la enfermedad de la reina María Amalia de Sajonia. El cuerpo también ha sufrido mutilaciones motivadas por el fervor religioso, como cuando una de las damas de Isabel la Católica arrancó de un mordisco un dedo de su pie, o cuando el cerrajero personal de Carlos II, llamado Tomás, arrancó un diente al santo y se lo regaló al monarca, que lo guardó hasta su muerte bajo la almohada.
El investigador del siglo XVII, Antonio de León Pinelo, es quien defiende que fue Felipe II en persona quien reclamó la canonización y que fray Domingo de Mendoza llevó a cabo todos los trámites. El cronista Joseph de la Cruz concede el protagonismo del proceso a Diego de Salas Barbadillo, quien habría solicitado la canonización al rey Felipe II en nombre de la Villa madrileña. Ciertamente hubo un empeño popular en que existiera canonización. La primera noticia oficial acerca del intento de canonización de Isidro aparece en los Libros de Actas del ayuntamiento madrileño el 23 de diciembre de 1562. Según figura en el acta, se presentó ante el concejo una comisión formada por tres miembros de la familia de los Lujanes y uno de los Vargas-Luján. Dichos vecinos plantearon que, aprovechando que el Comendador mayor de Castilla viajaba a Roma para la canonización de Diego de Alcalá, se hiciera allí mismo también el trámite de canonización de Isidro. El escritor Diego de Salas Barbadillo sin saber qué documentos consulta previamente, anuncia en el ayuntamiento de Madrid en el año 1592, obra que según autores se supone que fuera de su padre Alonso Jerónimo de Salas Barbadillo. El Ayuntamiento durante este periodo intentó buscar y reunir los documentos sobre la vida y hechos de San Isidro. Se hicieron bandos y se publicaron cartas de excomunión a proporcionar a aquel que proporcionara documentos. Pronto hubo fraudes que fueron denunciados mediante publicaciones de paulinas.
Fue beatificado por el papa Paulo V el 14 de junio de 1619, y el 12 de marzo de 1622 canonizado por Gregorio XV, junto a san Felipe Neri, santa Teresa de Jesús, san Ignacio de Loyola y san Francisco Javier, aunque la bula de canonización no fue publicada hasta 1724 por Benedicto XIII reinando ya en España Felipe V. La canonización hizo que se celebraran grandes fiestas en Madrid. Se determinó además que su festividad se celebraría el 15 de mayo y se aprobó su Patronazgo sobre la Villa y Corte de Madrid. A causa de este acontecimiento, la Cofradía de San Eloy de los Plateros de Madrid decidió donar un arca de plata para sustituir la vieja de madera de Alfonso VIII. El arca de los Plateros tenía en plata y bronce. El pueblo de Madrid reclama la edificación de una nueva capilla, que acogiera las reliquias y resultara de mayor envergadura y suntuosidad. En 1642 ya se había aprobado el proyecto del arquitecto Pedro de la Torre para la erección de una nueva capilla y se había comenzado la construcción de la misma, pero las obras fueron languideciendo hasta que en 1656 éstas se encontraban en completa ruina. El punto central de la capilla debía ser un baldaquino de estilo barroco, para el que presentó un diseño el artista Sebastián Herrera Barnuevo. Ya Felipe III antes de que San Isidro fuera canonizado, en el momento de su muerte, pedía al Santo que fuera su interlocutor ante Dios Padre.
El poder curativo del Santo se confió a la reina Doña Mariana de Neoburgo cuando en el verano de 1691 cayó enferma de gravedad debido a los remedios empleados por los médicos para la época para provocar el embarazo. Mariana fue la segunda esposa del rey Carlos II, el último monarca de la dinastía de la casa real de los Austrias. Se le administraron a Mariana los últimos sacramentos y se llevó en procesión el cuerpo de San Isidro al Alcázar para que este intercediera por la curación, en caso de fallecimiento, de la soberana. Durante nueve días consecutivos se oró en el Monasterio de las Descalzas, y por él pasaron todas las órdenes religiosas afincadas en Madrid. A principios de octubre de 1691 la enfermedad comenzó a remitir y en la Corte tuvieron lugar diferentes festejos para celebrar el restablecimiento de la reina. Al verse curada Mariana encargó una urna de plata para albergar las reliquias del Santo. En enero de 1692 la urna fue terminada y los costes fueron cargados a la nómina real. La antigua urna pasó a propiedad de Mariana. Durante su exilio en Toledo, de 1701 a 1706, la reina viuda había llevado consigo la antigua urna. Sin embargo, en su salida precipitada hacia Bayona parte de sus bienes quedaron en Toledo.
Durante años se creyó que su cuerpo incorrupto tenía poderes sanadores y la Familia Real española se valió de esta cualidad milagrosa a lo largo de la historia. Por ejemplo, cuando Felipe III enfermó de unas calenturas al regresar de Portugal y se vio obligado a permanecer en Casarrubios del Monte, en Toledo. La villa de Madrid organizó entonces una procesión por la curación del monarca y el cuerpo del Santo fue trasladado a esta localidad toledana. Durante el reinado de Carlos II también se confió en el Santo para que intercediera por su salud, trasladando sus reliquias al Alcázar Real de Madrid en 1696.
Los Borbones mantuvieron la creencia en los poderes curativos de la momia del santo y, en 1760, se llevó el cuerpo al Palacio Real durante la enfermedad de la reina María Amalia de Sajonia. El cuerpo también ha sufrido mutilaciones motivadas por el fervor religioso, como cuando una de las damas de Isabel la Católica arrancó de un mordisco un dedo de su pie, o cuando el cerrajero personal de Carlos II, llamado Tomás, arrancó un diente al santo y se lo regaló al monarca, que lo guardó hasta su muerte bajo la almohada.