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ALCONCHEL DE LA ESTRELLA: El testamento original de la reina se conserva en el...

El testamento original de la reina se conserva en el Real Monasterio de Santa María de Guadalupe. Una copia se envió al monasterio de Santa Isabel de la Alhambra de Granada. Y otra, a la catedral de Toledo, aunque desde 1575 pasó al Archivo General de Simancas.[21]

En él, dejó dicho que sus sucesores debían esforzarse en conquistar para el cristianismo el Norte de África siguiendo la reconquista peninsular, pero el descubrimiento de América hizo que los esfuerzos de los reinos castellanos se alejasen de ese objetivo.

Su empeño como defensora de la igualdad de sus súbditos americanos con los del Viejo Mundo le han ganado el título de Precursora de los Derechos Humanos por importantes historiadores (ello a pesar de haber decretado en Castilla la conversión obligada de los judíos, so pena de expulsión, Decreto de Granada, y más tarde, empujada por su marido y por el papado, a romper las Capitulaciones de Granada, pactadas con Boabdil, y obligar a la conversión a los musulmanes).

A su muerte le sucedió la hija de ambos, Juana, pero por poco tiempo, ya que fue declarada incapaz de reinar por "locura" y pasando el reino, primero al marido de ésta (Felipe I el Hermoso) y muy pronto al hijo de este matrimonio, y nieto de los Reyes Católicos, Carlos I.

En 1868 Eduardo Rosales representó el momento en el que la reina dicta su testamento en el cuadro Doña Isabel la Católica dictando su testamento.