el apartado anterior su ultima palabra es (virus)
como se trata
• Animales: Se obtuvieron muestras de tejidos provenientes de dos ovejas con
síntomas evidentes de LA (cojera, edema facial, descarga nasal y ulceración en las
encías). Tras la eutanasia con sobredosis de pentobarbital sódico se obtuvieron
muestras de bazo, arteria pulmonar, sangre y suero. Por cada oveja, se han analizado
cinco muestras distintas procedentes de cada tipo de tejido.
• Extracción de ARN: se parte de 100μ l de sangre, suero y del homogeneizado
de los tejidos. Se usó el reactivo Trizol (Invitrogen). El protocolo realizado se describe
61
ISSN: 1988-2688
RCCV Vol. 2 (2). 2008
en (Chomczynski et al., 1987). Brevemente, el proceso consta de separar todos los
componentes lipídicos de cada muestra, de la fase soluble en agua, donde se encuentra
el ARN. Después se realiza una precipitación del ARN con etanol y la muestra se
resuspende en agua libre de RNAsas.
• RT-PCR: Se amplificó el fragmento de ARN que codifica las proteínas VP2 y
NS1 usando cebadores genéricos del virus de LA (Figura 1) y específicos del serotipo
1 (Figura 2)
La reacción de RT-PCR consta de 40 ciclos en los que se repiten tres pasos
precedidos del paso de retrotranscriptasa, en el que esta enzima realiza copias de ADN
a partir de ARN a 48ºC. Los tres pasos de la PCR constan de: un paso a 95ºC para la
desnaturalización de las hebras, un paso a 52ºC para la unión de los cebadores y un
paso a 72ºC para que la polimerasa transcriba dando lugar a más copias. Se obtienen
mas de dos billones de copias del fragmento que queremos amplificar.
• Controles: Como control positivo se utilizó una muestra de ARN del virus de
LA del serotipo 1 obtenida por infección de un cultivo celular de células de riñón de
mono verde. Como control negativo se utilizó una muestra de ARN del virus del
síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS) y tres muestras en las que se
utilizó agua destilada para realizar el proceso de extracción de ARN.
• Electroforesis: gel de agarosa al 2% teñido con colorante SYBR-GREEN, que
se une a ácidos nucleicos de cadena doble, para visualizar los productos de la RTPCR.
Se usa un marcador de pesos moleculares como referencia, en el que cada banda
se corresponde con cien pares de bases. Esta técnica se basa en la carga parcial
negativa de la muestra que le permite el desplazamiento por el gel según su tamaño.
En la RT-PCR genérica el fragmento es de 274 pares de bases y en la específica del
serotipo 1 es de 765 pares de bases (Figura 3).
Resultados
Tras el análisis de cinco muestras de suero, sangre, bazo y arteria pulmonar procedentes
de dos ovejas con síntomas de LA, se obtuvieron los siguientes resultados:
• Ensayo de RT-PCR genérica de LA: únicamente las muestras de sangre de
una de las ovejas dieron resultado positivo con esta técnica.
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ISSN: 1988-2688
RCCV Vol. 2 (2). 2008
• Ensayo RT-PCR específica: Los resultados obtenidos son similares a los del
ensayo genérico, mostrando bandas positivas correspondientes al serotipo 1 de LA
sólo la muestra de sangre procedente de la oveja número 1.
• Secuenciación: el fragmento de ADN amplificado por la RT-PCR específica
se mandó a analizar al servicio de secuenciación SECUGEN, SL, comprobándose que
correspondía con serotipo 1 de LA.
Conclusiones
La técnica de RT-PCR es novedosa en cuanto a su aplicación para la detección
específica de serotipos de LA. Los estudios en los que se han desarrollado los cebadores para
la detección de los serotipos de LA presentes en Europa se han publicado recientemente
(Mertens et al., 2007). En este estudio hemos aplicado la técnica de RT-PCR para la detección
del virus en distintas muestras procedentes de ovejas con síntomas de LA. Los resultados
obtenidos han permitido detectar el virus de LA únicamente en sangre procedente de una de
las ovejas analizadas. Los resultados negativos en la detección del virus en las restantes
muestras, a pesar de la evidente sintomatología observada en los individuos, puede deberse a
dos razones. Puede suponerse que la RT-PCR no presenta suficiente sensibilidad para la
detección del virus en los tejidos analizados o que la infección era muy inicial y todavía no se
había acantonado en ellos y había una mayor proporción de partículas virales circulantes en
sangre.
La detección del virus solamente en sangre de una de las ovejas parece indicar que el
virus permanece unido a eritrocitos durante todo el periodo de viremia, por lo que esta
muestra sería la más adecuada para realizar estudios de detección del virus. A pesar de ello,
aún es necesario realizar más ensayos con un número mayor de muestras.
Agradecimientos
Se sugiere que se redacten en frases del tipo “Al Dr (o Drs). D.,…, del …. por …)
Dr. José Manuel Sánchez-Vizcaíno ¹
Belén Rodríguez Sánchez ¹
Dr. Pedro Sánchez Cordón ²
¹ Dpto. Sanidad Animal. Facultad Veterinaria. Universidad Complutense Madrid
² Dpto. Anatomía Patológica. Facultad Veterinaria. Universidad Córdoba.
como se trata
• Animales: Se obtuvieron muestras de tejidos provenientes de dos ovejas con
síntomas evidentes de LA (cojera, edema facial, descarga nasal y ulceración en las
encías). Tras la eutanasia con sobredosis de pentobarbital sódico se obtuvieron
muestras de bazo, arteria pulmonar, sangre y suero. Por cada oveja, se han analizado
cinco muestras distintas procedentes de cada tipo de tejido.
• Extracción de ARN: se parte de 100μ l de sangre, suero y del homogeneizado
de los tejidos. Se usó el reactivo Trizol (Invitrogen). El protocolo realizado se describe
61
ISSN: 1988-2688
RCCV Vol. 2 (2). 2008
en (Chomczynski et al., 1987). Brevemente, el proceso consta de separar todos los
componentes lipídicos de cada muestra, de la fase soluble en agua, donde se encuentra
el ARN. Después se realiza una precipitación del ARN con etanol y la muestra se
resuspende en agua libre de RNAsas.
• RT-PCR: Se amplificó el fragmento de ARN que codifica las proteínas VP2 y
NS1 usando cebadores genéricos del virus de LA (Figura 1) y específicos del serotipo
1 (Figura 2)
La reacción de RT-PCR consta de 40 ciclos en los que se repiten tres pasos
precedidos del paso de retrotranscriptasa, en el que esta enzima realiza copias de ADN
a partir de ARN a 48ºC. Los tres pasos de la PCR constan de: un paso a 95ºC para la
desnaturalización de las hebras, un paso a 52ºC para la unión de los cebadores y un
paso a 72ºC para que la polimerasa transcriba dando lugar a más copias. Se obtienen
mas de dos billones de copias del fragmento que queremos amplificar.
• Controles: Como control positivo se utilizó una muestra de ARN del virus de
LA del serotipo 1 obtenida por infección de un cultivo celular de células de riñón de
mono verde. Como control negativo se utilizó una muestra de ARN del virus del
síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS) y tres muestras en las que se
utilizó agua destilada para realizar el proceso de extracción de ARN.
• Electroforesis: gel de agarosa al 2% teñido con colorante SYBR-GREEN, que
se une a ácidos nucleicos de cadena doble, para visualizar los productos de la RTPCR.
Se usa un marcador de pesos moleculares como referencia, en el que cada banda
se corresponde con cien pares de bases. Esta técnica se basa en la carga parcial
negativa de la muestra que le permite el desplazamiento por el gel según su tamaño.
En la RT-PCR genérica el fragmento es de 274 pares de bases y en la específica del
serotipo 1 es de 765 pares de bases (Figura 3).
Resultados
Tras el análisis de cinco muestras de suero, sangre, bazo y arteria pulmonar procedentes
de dos ovejas con síntomas de LA, se obtuvieron los siguientes resultados:
• Ensayo de RT-PCR genérica de LA: únicamente las muestras de sangre de
una de las ovejas dieron resultado positivo con esta técnica.
62
ISSN: 1988-2688
RCCV Vol. 2 (2). 2008
• Ensayo RT-PCR específica: Los resultados obtenidos son similares a los del
ensayo genérico, mostrando bandas positivas correspondientes al serotipo 1 de LA
sólo la muestra de sangre procedente de la oveja número 1.
• Secuenciación: el fragmento de ADN amplificado por la RT-PCR específica
se mandó a analizar al servicio de secuenciación SECUGEN, SL, comprobándose que
correspondía con serotipo 1 de LA.
Conclusiones
La técnica de RT-PCR es novedosa en cuanto a su aplicación para la detección
específica de serotipos de LA. Los estudios en los que se han desarrollado los cebadores para
la detección de los serotipos de LA presentes en Europa se han publicado recientemente
(Mertens et al., 2007). En este estudio hemos aplicado la técnica de RT-PCR para la detección
del virus en distintas muestras procedentes de ovejas con síntomas de LA. Los resultados
obtenidos han permitido detectar el virus de LA únicamente en sangre procedente de una de
las ovejas analizadas. Los resultados negativos en la detección del virus en las restantes
muestras, a pesar de la evidente sintomatología observada en los individuos, puede deberse a
dos razones. Puede suponerse que la RT-PCR no presenta suficiente sensibilidad para la
detección del virus en los tejidos analizados o que la infección era muy inicial y todavía no se
había acantonado en ellos y había una mayor proporción de partículas virales circulantes en
sangre.
La detección del virus solamente en sangre de una de las ovejas parece indicar que el
virus permanece unido a eritrocitos durante todo el periodo de viremia, por lo que esta
muestra sería la más adecuada para realizar estudios de detección del virus. A pesar de ello,
aún es necesario realizar más ensayos con un número mayor de muestras.
Agradecimientos
Se sugiere que se redacten en frases del tipo “Al Dr (o Drs). D.,…, del …. por …)
Dr. José Manuel Sánchez-Vizcaíno ¹
Belén Rodríguez Sánchez ¹
Dr. Pedro Sánchez Cordón ²
¹ Dpto. Sanidad Animal. Facultad Veterinaria. Universidad Complutense Madrid
² Dpto. Anatomía Patológica. Facultad Veterinaria. Universidad Córdoba.