El retablo mayor de la Cartuja fue tallado en madera por el artista Gil de Siloé y policromado y dorado por Diego de la Cruz, con oro que procedía de los primeros envíos del continente americano tras el descubrimiento. 4​ Realizado entre 1496 y 1499, se trata sin duda de una de las obras más importantes de la escultura gótica hispana, por su originalidad compositiva e iconográfica y la excelente calidad de la talla, valorada por la policromía.

Retablo mayor y sepulcro de Juan II e Isabel de Portugal.
Uno de los elementos más destacados del retablo es la rueda angélica en la que se enmarca la imagen de Cristo crucificado, de belleza y expresividad acentuadas significativamente por el trabajo de policromía de Diego de la Cruz. En la parte más externa de la rueda se sitúan las figuras de Dios Padre, a la izquierda, y del Espíritu Santo, a la derecha, sosteniendo el travesaño de la cruz.

En la parte inferior del madero, completan la escena las figuras de la Virgen María y San Juan Evangelista. El pelícano situado en la parte superior de la cruz confiere al conjunto central un gran valor simbólico, alegoría del sacrificio eucarístico, porque el ave alimenta a sus crías con su propia sangre. 5​

En el retablo también se ubican las efigies orantes de Juan II de Castilla, vestido con un manto dorado con la divisa del Ristre, y de su esposa la reina Isabel de Portugal.