Obra quizás del maestro Juan de Matienzo, fue contratada en 1529 por Juan de Castro y su esposa Inés de Lerma. Su fábrica responde a la tipología de capillas funerarias inspiradas en el modelo catedralicio de los Condestables. Tras cruzar su elegante arco de entrada, volteado sobre dos bellas pilastras de estilo plateresco y obra de Juan de Vallejo, se pasa al interior, cubierto con bóveda octogonal estrellada, de plementería calada (abierta en 1980) en su claraboya circular central, y apoyada sobre pechinas con forma de concha.

El retablo, de traza plateresca y sabor tardogótico en la decoración, está dedicado a la Natividad de María y consta de doce escenas narrativas tratadas con gran minuciosidad; a sus flancos, dos sepulcros manieristas bajo arcosolio correspondientes a los fundadores, Juan de Castro e Inés de Lerma Polanco, fallecidos ambos en 1548, y a los padres de él, Juan García de Castro y Teresa de Múgica. A la derecha de la entrada a la capilla se sitúa el sepulcro del hijo de los fundadores, el canónigo Jerónimo de Castro, fallecido en 1573, primer patrono de la capilla, efigiado orante y acompañado por San Miguel y el Ángel Custodio. Es una obra asignada a Juan de Vallejo. Completan las obras contenidas en esta capilla, entre otros, una pila bautismal y dos cuadros con escenas de la vida de San Gil.

En la nave del Evangelio se suceden dos sepulcros adosados al muro. Uno, renacentista, corresponde a Alonso Pisquer y a su hijo Diego, en el que se representa la imposición de la casulla a San Ildefonso. Es obra de Francisco de Colonia. El que sigue es gótico, hecho en pizarra, y en él están yacentes Diego de Frías (+1490) y su esposa Marina García de Espinosa (+1516), cuyo frente tiene a los santos Pedro, Pablo y Santiago. Este sepulcro fue realizado por Simón de Colonia, padre del anterior.