Diseñado el monasterio y el edificio eclesial por Juan de Colonia, se iniciaron los trabajos en 1454, para concluir en 1483 bajo la dirección de su hijo Sirnón, una vez que Isabel la Católica decidió impulsar esta obra que serviría de panteón a sus padres y hermano.
El templo, de elegante traza arquitectónica en estilo gótico tardío (isabelino), alberga obras del genial escultor Gil de Siloé, como el retablo mayor, policromado por Diego de la Cruz, con parte del oro que trajo Colón de América, y los sepulcros del fundador Juan II y su esposa Isabel de Portugal y el del infante don Alfonso.