Tras un breve retorno a León, embarcó hacia las costas de Perú, donde se unió a la expedición que preparaba Francisco Pizarro contra el Imperio inca (1532). Tras haber ayudado a Pizarro a combatir a las tribus locales, completó en 1534 la conquista de Quito usando fondos obtenidos de sus campañas anteriores. Quito había sido la ciudad más septentrional del Imperio inca hasta ese momento, y antes de ser tomada por Belalcázar fue incendiada por el caudillo inca Rumiñahui, tras enviar el tesoro de la ciudad hacia los Andes. Belalcázar y Almagro fundaron así la nueva ciudad de Quito sobre las ruinas de la antigua población inca, llamándola San Francisco de Quito, en honor a los misioneros franciscanos, por lo que en el escudo de la ciudad consta el tradicional cordón franciscano.