Espinosa decidió realizar una nueva expedición, partiendo en diciembre con 200 hombres, entre los que estaba un ya recuperado Almagro, y Francisco Pizarro, quien por primera vez tenía el título de capitán. En esta expedición, que duró 14 meses, se encontró con el padre Hernando de Luque a quien ya conocía anteriormente. Aunque la famosa sociedad entre los tres no estaba aún realizada, ya se demostraban confianza y amistad. Tomó parte en las incursiones, fundaciones y conquistas desarrolladas en el golfo de Panamá, participando nuevamente en una de las expediciones de Espinosa, que se transportaba en dos barcos de Balboa. De Almagro en esta expedición sólo se sabe que sirvió como testigo en listas, que en cada acontecimiento relacionado con indígenas, hacía levantar Espinosa. Permaneció en la recién fundada ciudad Santa María la Antigua del Darién, ayudando a poblarla. Durante cuatro años no participó de nuevas expediciones, ocupando su tiempo en la administración de sus bienes y los de Pizarro.