Tras recibir la extremaunción, falleció en la madrugada del 21 de septiembre de 1558, dejando tres hijos legítimos de su matrimonio con doña Isabel de Portugal (Felipe II, María, reina de Bohemia, y Juana, princesa de Portugal), además de varios bastardos, entre los cuales el más célebre sería don Juan de Austria, concebido por la rolliza campesina Barbara Blomberg en 1545. Joven de simpatía arrolladora, Juan de Austria habría de comandar, años más tarde, las fuerzas españolas frente a las turcas en la batalla de Lepanto, y llegaría a ser gobernador de los Países Bajos.