La acción de Francisco I, aliado con el papa Clemente VII, obligó a Carlos V a responder enérgicamente. Su ejército derrotó a las tropas francesas e hizo prisionero al rey francés en Pavía, el 10 de marzo de 1525. Dos años más tarde, Carlos atacó al papa y su ejército entró en Roma. Las tropas españolas y alemanas saquearon la ciudad durante una semana. Poco después, la deserción de Andrea Doria de Francia dotó a Carlos de una potente flota y forzó al papa a recibirlo en Roma. La Paz de Cambrai, firmada el 3 de agosto de 1529, obligó a Francisco I a reconocer la soberanía del emperador sobre Milán, Génova y Nápoles.