En 1580 el monasterio acogió a María de Austria, viuda del emperador Maximiliano II de Habsburgo, que llegó con su hija de trece años, Margarita. La emperatriz adoptó el régimen de la comunidad y su hija profesó como monja. María de Austria dio en el convento una grandiosa fiesta el 22 de abril de 1602, de acuerdo con el Concejo de la Villa y los frailes de Atocha, para agasajar al rey Felipe III y persuadirle de que no trasladara la corte a Valladolid. El agasajo duró tres días, con gran complacencia del rey, pero el traslado de la corte se hizo realidad. María de Austria murió el 21 de febrero de 1603, pidiendo en su testamento ser enterrada al pie del altar de la Oración del Huerto, en el claustro bajo, con una piedra llana y lisa como lápida. Trece años más tarde Felipe III trasladó el cadáver a un sepulcro lujoso hecho de mármoles y bronce, colocado en el coro de la iglesia.
El compositor renacentista Tomás Luis de Victoria ejerció, al menos, desde 1587 hasta el día de su muerte, en agosto de 1611, primero el cargo de capellán de la emperatriz María de Austria y, luego, desde 1606, de organista en el monasterio. El espacio del monasterio era enorme y en él estaba comprendida una gran huerta además de la iglesia y las dependencias monacales. A lo largo de los años ingresaron aquí mujeres de la casa real y de la alta aristocracia, haciendo importantes regalos y donaciones por lo que el monasterio llegó a a tener un verdadero tesoro en obras de arte.

(19 de Marzo de 2019)